SZ nr 93–100/2018z 13 grudnia 2018 r.
Metabolomika: Medycyna łapie oddech
Beata Ignasiak, Marek Jurgowiak
To, że oddech chorego może dostarczyć wiedzy o jego stanie zdrowia – wiedziano już w starożytności. Ponad 200 lat temu Antoine Lavoisier uważany za „ojca biochemii” zainicjował nowoczesne badania nad procesami oddychania. Obecnie pojawiły się już możliwości dokładnych analiz chemicznych wydychanego powietrza, a wraz z nimi nadzieje na bezinwazyjne diagnozowanie szeregu chorób z wykorzystaniem biomarkerów i, co ważne, diagnozowanych we wczesnych stadiach ich rozwoju. Rozkwita przy tym szybko dziedzina nauki znana jako metabolomika, dążąca do poznania wszystkich metabolitów powstających w organizmie człowieka i obecnych także w powietrzu, które wydychamy.
Co wisi w powietrzu
Po erze genomiki i proteomiki nastał czas – metabolomiki. To dziedzina nauki stawiająca sobie za cel poznanie wszystkich metabolitów (produktów przemian biochemicznych) powstających podczas procesów życiowych na poziomie każdej komórki i organizmu człowieka. Czy jest to w pełni możliwe? Odpowiedź na to pytanie jest kwestią czasu. Z całą pewnością znamy już szereg metabolitów, które powstając w tkankach przedostają się do krwi, a stamtąd do płuc. Można je następnie wykryć w wydychanym powietrzu.
Dotąd jedynie w przypadku acetonu i izoprenu określono jednoznacznie szlaki, w których powstają te związki oraz drogi ich pochodzenia w wydychanym powietrzu. To pokazuje, jak niełatwo jest zaklasyfikować dany związek czy molekułę jako biomarker jednostki chorobowej czy procesu metabolicznego.
Nie zapominajmy przy tym, że w oddechu obecne są też substancje egzogennego pochodzenia, dostarczane choćby z pokarmem, lekami oraz z powietrza atmosferycznego. Wiele z nich jest także skutkiem emisji lotnych związków chemicznych pochodzących z mebli, podłóg, wykładzin, tworzyw sztucznych, czy stosowanych powszechnie detergentów. Ważne zatem staje się też rozróżnianie substancji produkowanych naturalnie przez organizmy i ich mikrobiomy (mikroorganizmy zasiedlające ciało człowieka) od substancji pochodzących ze środowiska życia, a nadal nastręcza to badaczom szereg problemów.
Analizy i testy
Detekcja metabolitów stała się możliwa dzięki chromatograficznej analizie składu wydychanego powietrza. Uzyskaliśmy obiecujące narzędzie diagnostyczne o wielu zaletach. Taka analiza bowiem jest szybka, nieinwazyjna, a zatem i bezbolesna dla pacjenta, a pobranie próbek do badań jest bezpieczne i wygodne także dla personelu medycznego. W czasach Hipokratesa lekarze już wiedzieli, że zapach oddechu jest cennym elementem diagnozowania pacjenta. I nadal wiele lat później kojarzono słodką owocową woń acetonu z niewyrównaną cukrzycą czy podobną do zapachu moczu woń towarzyszącą niewydolności nerek. Niemniej odejście od takiego „obwąchiwania” pacjenta umożliwiły dopiero nowoczesne metody analityczne. Należą do nich narzędzia chemii analitycznej umożliwiające detekcję lotnych związków organicznych zawartych w wydychanym powietrzu, a te mogą stać się lub wręcz są już uznane za biomarkery chorób człowieka. Wystarczy wspomnieć tu ureazowy test oddechowy polegający na wykrywaniu produktów aktywności enzymu ureazy, pałeczek Helicobacter pylori, w powietrzu wydychanym przez pacjenta. W wyniku działania ureazy H. pylori obecnej w żołądku, mocznik podany pacjentowi rozkłada się do amoniaku i dwutlenku węgla (CO2). Wyraźny wzrost stężenia dwutlenku węgla znakowanego izotopem węgla, w powietrzu wydychanym przez pacjenta, świadczy o zakażeniu pałeczkami H. pylori. To już uznany test stosowany w laboratoriach jako Ureazowy Test Oddechowy (UBT, ang. Urea Breath Test). W Polsce, co warto przypomnieć, 80% osób dorosłych i 30% dzieci zakażonych jest bakterią H. pylori.
Ureazowy test oddechowy
Do układu pokarmowego pacjenta wprowadza się mocznik znakowany izotopami węgla C-13. Mocznik rozpuszczany jest w wodzie lub soku pomarańczowym i jabłkowym. W wyniku działania enzymu ureazy produkowanego przez obecne w żołądku pałeczki Helicobacter pylori mocznik ulega rozkładowi do amoniaku i dwutlenku węgla. Po upływie 20 minut od podania pacjentowi mocznika dokonuje się pomiaru zawartości CO2 znakowanego izotopem w wydychanym powietrzu (C-13 – mocznik to dziś najczęściej stosowany test, niegdyś stosowano także izotop C-14). Obecność odpowiedniej ilości znakowanego izotopem CO2 w wydychanym powietrzu świadczy o zakażeniu bakterią H. pylori. Taki test umożliwia nie tylko wykrywanie zakażeń, ale także monitorowanie skuteczności leczenia farmakologicznego z pominięciem badania gastroskopowego. Umożliwia także badania skriningowe osób zakażonych, a nie wykazujących objawów oraz prowadzenie nawet na dużą skalę badań epidemiologicznych. Wykorzystanie nieradioaktywnego izotopu C-13 umożliwia nie tylko wielokrotne stosowanie testu u tych samych pacjentów, ale także wykorzystanie testu UBT w badaniach dzieci i kobiet będących w ciąży. Takie testy cieszą się dużą akceptacją pacjentów zwłaszcza w porównaniu z pobraniem wycinka z żołądka w czasie badania endoskopowego, a sama metoda cechuje się dużą czułością (90–96%) i swoistością (88–98%)
E-nosy węszą
A jakie inne możliwości badawcze i analityczne mogą przynieść testy oddechowe?
Postęp w analizowaniu składu wydychanego powietrza to efekt zastosowania najnowocześniejszych technik analitycznych, takich jak chromatografia gazowa (GC – Gas Chromatography), w tym sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS – Mass Spectrometry), spektroskopia laserowa i wiele innych, w tym elektroniczne nosy (e-nosy). Nowoczesne systemy chromatograficzne wymienione wyżej są jeszcze zazwyczaj drogie, wymagają złożonych procedur eksploatacyjnych i specjalistycznej wiedzy. Nie do końca zatem nadają się do powszechnych badań przesiewowych. Elektroniczne nosy są urządzeniami składającymi się z grup autonomicznych sensorów, z których każdy jest czuły na obecność specyficznych lotnych substancji. Działanie takich sensorów opiera się na rozróżnieniu masy cząsteczkowej związków organicznych, kształtu cząsteczek, ich hydrofilności i innych. Z użyciem tych technik można było wykazać, że pewne substancje (związki) pojawiające się w wydychanym powietrzu lub zmiana ich stężenia mogą świadczyć o toczących się w organizmie procesach chorobowych. Ponadto badania takie mogą być przydatne dla uzyskania informacji o przebiegu prawidłowych procesów biochemicznych przebiegających w organizmie. Nadzieje wiąże się również z możliwością uzyskiwania informacji o stosowanych przez pacjenta lekach czy też używkach (także narkotykach, przez wiele dni po paleniu marihuany można wykryć jej metabolity w wydychanym powietrzu) oraz rodzajach stosowanej diety.
Brytyjczycy rozwijają projekt Diag-Nose, w którym sztuczny nos diagnozuje zapalenie dróg moczowych. Test taki pozwala w ciągu godziny wykryć pałeczki okrężnicy E. coli i odmieńca Proteus mirabilis z precyzją do 98%. Zadziwić może także fakt, że e-nosy planuje się do wykorzystania w monitorowaniu cyklu miesiączkowego u kobiet i monitorowaniu okresów płodności. Włoscy naukowcy z Università Cattolica del Sacro Cuore badali jaką zdolność diagnostyczną mają e-nosy w diagnozowaniu astmy. Zdolność diagnostyczna sztucznego nosa, w tym przypadku, oszacowana została na 87,5%. Badacze z uniwersytetu w Newcastle opracowali e-nos wykrywający białka i inne molekuły produkowane przez komórki nowotworowe. W pracowniach Uniwersytetu Carleton próbuje się tymi metodami przewidzieć zawał serca, „wywąchując” niepokojące objawy niewydolności układu krążenia, podobnie choroby wątroby oraz cukrzycę.
W Polsce badaniami nad wykorzystaniem metod spektroskopowych do badań przesiewowych w diagnostyce medycznej przy użyciu czujników optoelektronicznych zajmują się między innymi naukowcy z Instytutu Fizyki Doświadczalnej Wydziału Fizyki UW oraz Instytutu Optoelektroniki WAT. Duży wkład w badania nad testami oddechowymi ma zespół Wydziału Chemii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika pracujący pod kierunkiem prof. Bogusława Buszewskiego.
W 1971 roku Linus Pauling, stosując techniki chromatograficzne, wykrył w powietrzu oddechowym ponad 250 lotnych związków. Obecnie u zdrowych ludzi wykrywanych jest co najmniej 400 lotnych związków organicznych. To świadczy dobitnie o złożoności naszego metabolizmu i raz jeszcze pokazuje jak duże trudności sprawia ustalenie dobrych czynników markerowych, które pozwalałyby na rzetelne diagnozowanie chorób i zaburzeń metabolizmu. Niemniej testy oddechowe pozwalają obecnie na diagnozowanie takich chorób jak zespoły złego wchłaniania, pozwalają na rozpoznawanie uszkodzeń trzustki czy chorób jelita cienkiego oraz wspomnianych już chorób żołądka (choroba wrzodowa i przewlekły nieżyt powodowane namnożeniem bakterii H. pylori). Ponadto diagnozować można choroby wątroby (marskość, zapalenie wątroby) i niektóre typy nowotworów, a ostatnio pojawiła się taka szansa nawet w odniesieniu do chorób psychiatrycznych. Odkryto bowiem u pacjentów z ostrą psychozą schizofrenopodobną podwyższone stężenie pentanu w wydychanym powietrzu. Poziom tego metabolitu szybko zaś wracał do normy, kiedy stan pacjentów poddanych terapii ulegał poprawie w badaniu klinicznym.
W badaniach obecności w wydychanym powietrzu szeregu związków podstawowe staje się pytanie o ich pochodzenie. Na przykład, obecność dwusiarczku węgla może być wynikiem rozpadu aminokwasów zawierających siarkę, ale związek ten wykrywany jest także w wydychanym powietrzu mieszkańców takich aglomeracji jak np. Nowy Jork, o dużym stopniu zanieczyszczenia środowiska. Pochodzenie tego związku staje się o tyle ważne, jak wykazały najnowsze badania, że ekspozycja na dwusiarczek węgla obecny w środowisku, może nasilać rozwój miażdżycy i choroby wieńcowej.
Rak, markery… i psy
Stale zwraca się uwagę na nowe markery i jednocześnie komplikacje, jakie przynoszą najnowsze odkrycia, dając jednocześnie nadzieję na diagnozowanie takich chorób cywilizacyjnych, jak chociażby nowotwory. Na przykład odkryto, że powietrze wydychane przez chorych na raka płuc zawiera wyższe stężenie acetonu, metyloetyloketonu, n-propanolu, aldehydu toluilowego i oksepanonu. To być może przyspieszy możliwość wczesnego i pewnego wykrywania tej zabójczej choroby. Zanim jednak takie markery znajdą zastosowania kliniczne, muszą zostać zebrane dane dotyczące czułości i specyficzności takich testów, a także ich wartości diagnostycznej. Rak płuca jest wiodącą przyczyną zgonów wśród chorób nowotworowych z około 88-proc. pięcioletnią umieralnością niezależnie od typu histologicznego guza. Wysoka śmiertelność to przede wszystkim efekt późnego wykrywania choroby i niskiej skuteczności samej terapii onkologicznej. Co przy tym ważne, wykrycie raka płuca we wczesnych stadiach choroby zwiększa szansę 5-letniego przeżycia aż do 60–80%. Ponadto, dotychczasowe badania przesiewowe w grupach ryzyka są nie tylko kosztowne, ale i jako badania obrazowe narażają pacjentów na działanie promieniowania jonizującego. I chociaż dotychczas nie rozstrzygnięto jednoznacznie czy oznaczanie biomarkerów raka płuc w powietrzu wydychanym może być przydatne w praktyce klinicznej do wykrywania nowotworów lub różnicowania etiologii zmian ogniskowych płuc, to należy pamiętać, że analiza wydychanego powietrza w diagnostyce klinicznej jest dziedziną dość młodą, choć szybko rozwijającą się.
Detekcja markerów chorób nowotworowych jest możliwa, choć zabrzmi to sensacyjnie, także z udziałem wytresowanych odpowiednio… psów. Po kilkumiesięcznej tresurze psy są w stanie wykryć raka płuc u 93% populacji spośród kilkuset osób chorych. Niemniej, jak można domniemać, metoda ta ze względu na pewne kłopoty w zastosowaniach praktycznych nie tak szybko, jeśli w ogóle, stanie się na tyle popularna, że znajdzie szersze zastosowania.
Być może w nieodległej przyszłości testowanie wydychanego powietrza stanie się wreszcie stosunkowo niedrogim, masowym i łatwym badaniem, które pomoże w rozpoznaniu chorób w ich wczesnych stadiach, a to jak wiemy zawsze pomaga w walce z chorobą i daje szanse szybszego powrotu pacjenta do zdrowia z jednoczesnym uniknięciem szeregu powikłań, jakie niesie ze sobą każde zaawansowane w rozwoju schorzenie.
Co ciekawe, testy oddechowe umożliwiają także szybkie reagowanie np. na niedobory niektórych witamin i mikroelementów, aby w porę zapobiec ich skutkom. Wiemy bowiem obecnie, że podwyższony poziom etanu w wydechu człowieka występuje w przypadku niedoborów witaminy E (witamina płodności) oraz selenu i miedzi.
W jaki sposób dalszy rozwój technik badawczych i naszej wiedzy o metabolizmie wpłynie na możliwości diagnozowania pacjentów i poznanie przebiegu procesów życiowych w zdrowiu i chorobie człowieka zastanawiają się już dzisiaj nie tylko lekarze i specjaliści od technik analitycznych, ale i wielu zjadaczy chleba odsuwających od siebie myśl o wielu uciążliwych i nieprzyjemnych inwazyjnych badaniach, jakie mogą być naszym udziałem w walce z chorobami.
Możemy też już dzisiaj mieć nadzieję, że urządzenia analityczne badające wydech będą wkrótce przystosowane do używania już nie tylko w szpitalach i laboratoriach analitycznych czy gabinetach lekarskich, ale wręcz nawet w naszych domach.
Historia badań
Pionierami badań nad wydychanym powietrzem byli Lavoisier i Laplace. W roku 1784, analizując proces oddychania u świnki morskiej, wykazali, że zwierzę to wdychało tlen, a wydychało w powietrzu dwutlenek węgla. Była to pierwsza obserwacja przemian metabolicznych w organizmie i początek rozwoju nowej wówczas nauki – biochemii.
W 1874 roku brytyjski neurolog F.E. Anstie stosując analizę kolorymetryczną wykazał, że alkohol wprowadzony do organizmu jest metabolizowany. Były to pierwsze badania nad przemianami alkoholu w organizmie człowieka. Analizę kolorymetryczną, wprowadzoną w połowie XIX wieku, wykorzystał w pionierski sposób także niemiecki lekarz A. Nebelthau do analizy powietrza wydychanego przez chorych na cukrzycę, wykazując wydalanie przez płuca osób chorych większych ilości acetonu.
Chromatografię zapoczątkował badacz rosyjski M.S. Cwiet, publikując w 1904 roku pracę wykonaną zresztą w Warszawie, o rozdzielaniu naturalnych barwników organicznych na kolumnie wypełnionej węglanem wapnia. Metody chromatograficzne to obecnie najbardziej rozpowszechniona metoda rozdzielania mieszanin w toku analizy.
Rok 1971 to początek chromatograficznego badania oddechu. Wówczas Linus Pauling, stosując chromatografię gazową, wykazał obecność 250 lotnych związków w wydychanym przez człowieka powietrzu. Przełomowym dla separacji i identyfikacji tych związków było zastosowanie chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas przez takich badaczy jak Bengt T. Larson, S. Chen i M. Philips.