CRISPR-Cas9: Jeden „lek” na 7000 chorób?

Rewolucja wybuchła 28 czerwca 2016 roku. Sześcioro naukowców opisało w swoim artykule mechanizm nazwany przez jednego z nich CRISPR-Cas9, pozwalający na modyfikowanie genomów dowolnych organizmów. Brzmi to jak science fiction, ale jest czystą science.

Fot. Thinkstock

CRISPR (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats) oznacza zgrupowane, regularnie rozmieszczone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromowe. Naukowcy od końca lat 80. starali się określić rolę loci CRISPR. Początkowo uważano, że mechanizm ten odpowiada za naprawę DNA oraz regulację ekspresji genów. Badania przeprowadzone w 2002 roku pozwoliły zidentyfikować białka Cas (ang. CRISPR associated proteins) związane z mechanizmem CRISPR. Udowodniono, że ochrona przed infekcjami fagowymi należy do jednego z głównych zadań systemu CRISPR-Cas.

Mechanizm działania CRISPR-Cas9 przypomina ludzki system odpornościowy. Wirus, atakujący bakterię, narusza jej błonę komórkową i wprowadza własny materiał genetyczny do komórki. Komórka korzysta z informacji zawartych w sekcji CRISPR i tworzy enzymy, mające zniszczyć materiał genetyczny wirusa. Enzym Cas9, zawierający fragment gRNA (guide RNA) o wzorcu komplementarnym do materiału genetycznego wirusa, przyczepia się do nici w odpowiednim miejscu, przecinając ją w konkretnym miejscu, co czyni wirusowe DNA niegroźnym.

Bardzo precyzyjnie pocięte fragmenty wirusowego DNA zostają następnie dodane do DNA zaatakowanej bakterii w sekcji CRISPR, tworząc pewnego rodzaju pamięć immunologiczną bakterii, dzięki której w przyszłości może ona szybciej zidentyfikować i zneutralizować zagrożenie. Zastosowany w laboratorium, system CRISPR działa podobnie. Naukowcy wytwarzają cząsteczkę RNA, która może rozpoznać i przyłączyć się do konkretnego miejsca w DNA. RNA związane jest z enzymem Cas9, zdolnym do precyzyjnego przecięcia nici i usunięcia konkretnej sekwencji DNA. Następnie, analogicznie jak w systemie bakteryjnym, można w miejsce wycięcia niechcianej sekwencji wstawić inną.

Przedstawiony, uproszczony mechanizm działania leży u podstaw niesamowicie potężnego narzędzia inżynierii genetycznej. Można ją wykorzystać do zmutowania określonego genu po to, by uzyskać informację o roli danego genu w metabolizmie lub rozwoju osobnika i otrzymać zwierzęta modelowe do badania określonych chorób genetycznych człowieka. Można też „naprawić” zmutowany gen poprzez wprowadzenie odpowiedniej sekwencji DNA. Manipulacji tych można dokonywać zarówno w komórkach somatycznych, jak i płciowych.

Rewolucyjność CRISPR to połączenie:

• wszechstronności – znając sekwencję DNA organizmu, możemy pociąć DNA, usunąć lub zmienić fragment,

• prostoty przygotowania,

• precyzji,

• taniości – zmiana genu poprzednimi metodami, np. ZEN kosztowała setki tys. dolarów i zajmowała miesiące. Dziś można kupić gotowe zestawy CRISPR za 130 dolarów. Dzięki temu prace nad tą metodą trwają nawet w zniszczonym wojną Iraku.


Ulepszyliśmy rośliny i zwierzęta

Efekty tego odkrycia zobaczymy w najbliższych latach w gospodarstwach rolnych i medycynie. Wyhodowano już nowe odmiany roślin, na przykład ziemniaki ze zwiększoną zawartością witamin A i D, pszenicę z większą zawartością błonnika. Ryż C4 (którego stworzenie finansowała fundacja Billa Gatesa) daje o 20 proc. większe plony niż niezmodyfikowany, a dzięki lepszemu wykorzystaniu fotosyntezy potrzebuje do tego mniej wody. Dzięki modyfikacjom genetycznym roślin możemy się raczej nie obawiać głodu wynikającego z eksplozji demograficznej i ocieplania klimatu. Badania nad modyfikowaną genetycznie żywnością mają szansę na szybki rozwój, ponieważ amerykański Departament Rolnictwa zadecydował, że nie będzie kontrolować roślin modyfikowanych za pomocą technologii CRISPR, jeśli nie będą tworzone z udziałem obcych genów (czyli nie będą stricte GMO). W Europie na tego typu żywność poczekamy dłużej, gdyż Europejski Trybunał Sprawiedliwości wydał wyrok uznający organizmy modyfikowane za pomocą CRISPR-Cas9 za rodzaj GMO i tym samym praktycznie wykluczył je z rynku.

Jeśli chodzi o zwierzęta, dinozaurów najprawdopodobniej nie odtworzymy, ale dzięki CRISPR-Cas9 uda się nam przywrócić wymarłe gatunki, których DNA mamy. Już w 2015 roku chińscy naukowcy usunęli psom gen odpowiedzialny za hamowanie rozwoju muskulatury. Efektem tego było powstanie beagli z podwójną masą mięśniową. Ten eksperyment był istotny z dwóch powodów, po pierwsze eksperymentu dokonano na dużych ssakach, po drugie obnażono niedoskonałość metody. Zmodyfikowano 65 zarodków, urodziło się 27 szczeniąt z czego tylko u jednego obie kopie genu zostały usunięte ze wszystkich komórek mięśniowych. Badania będą kontynuowane celem dostarczenia takich zwierząt na potrzeby policji i wojska. Również chińscy naukowcy przeprowadzili udane próby modyfikacji genetycznych z wykorzystaniem technologii CRISPR-Cas9 u świń (małe kilkunastokilogramowe odpowiedniki zwykłych świń), królików, szczurów i małp. Dzięki jednogenowej modyfikacji naukowcy z Edynburga wyhodowali rasę świń odporną na PRRS – wirus powodujący śmierć trzody, co przynosi hodowcom z Europy i USA duże straty. Na przeszkodzie stoją przepisy prawne. Na początku 2017 roku Amerykańska Agencja Żywności i Leków ogłosiła, że inaczej niż rośliny będzie traktowała zwierzęta GMO, nawet jeśli nie zostanie wprowadzony obcy gen. Zmiany w genach roślin i zwierząt, skądinąd ciekawe i pożytecznie nie są kluczowe.


Modyfikacje genetyczne, czy to dokonywane starszymi metodami, czy za pomocą CRISPR-Cas9 muszą spełniać przynajmniej trzy podstawowe warunki:

• Zmiany muszą być powszechne, dokonywane jednocześnie i w odpowiedniej liczbie komórek. Zmiana w jednej komórce nie pomoże osiągnąć sukcesu terapeutycznego, taka zmiana musi się wydarzyć w większości lub wszystkich komórkach związanych z cechą lub chorobą, np. we wszystkich komórkach trzustki.

• Muszą być precyzyjne, nie może dojść do zmiany w innym genie niż zamierzony. W przypadku błędu na tym poziomie skutki uboczne mogą przewyższać korzyści.

• Zmiany powinny być trwałe, najlepiej tak, aby wystarczyła jednorazowa manipulacja.


Ulepszyliśmy metody
leczenia chorób

Pod koniec 2017 roku sukcesem zakończyły się wstępne badania nad leczeniem hemofilii typu A. Wśród trzynastu pacjentów, którym podano JEDNĄ (!) kroplówkę zawierającą brakujący gen odpowiedzialny za krzepnięcie krwi (wraz z wirusem dostarczającym gen do komórek), u jedenastu krzepliwość osiągnęła normalny poziom i utrzymywała się przez półtora roku po zabiegu. Włoski biolog i lekarz Michele De Luca zdołał wyleczyć dziecko cierpiące na pęcherzykowe oddzielanie naskórka. Dziecku przeszczepiono wyhodowaną w laboratorium skórę ze zmodyfikowanymi komórkami macierzystymi. Dziecko nie choruje i żyje normalnie. Zespół polskich naukowców pod kierownictwem Marty Olejniczak w badaniu z 2018 roku z powodzeniem zmienił wadliwy gen powodujący chorobę Huntingtona (zmodyfikowana metoda CRISPR-Cas9). Technologia okazała się bezpieczna, bardzo precyzyjna i nie przynosi skutków ubocznych.

Skuteczne wprowadzenie obcego DNA w wybrane miejsce mogłoby być w przyszłości wykorzystane w leczeniu chorób jednogenowych, jak na przykład dystrofia mięśniowa Duchenne’a czy mukowiscydoza. Edycja genomu polegająca na usunięciu fragmentu genu lub naprawie genu mogłaby doprowadzić do pojawienia się aktywnej dystrofiny i wyleczyć chorobę Duchenne’a. Analiza znanych mutacji w genie dystrofiny u pacjentów pozwoliła na przedstawienie opinii, że aż 80% chorych miałoby szansę na częściowe przywrócenie funkcjonalnego białka dzięki edycji genomu (np. z wykorzystaniem CRISPR-Cas). Wyniki badań wskazują, że długotrwały efekt terapeutyczny można byłoby uzyskać, wprowadzając zmiany w genomie komórek satelitowych mięśni.

CRISPR może być wykorzystywany nie tylko do naprawiania wadliwych genów, ale też do zwalczania wirusów, czego dowiedli japońscy naukowcy. Im, jako pierwszym, udało się wyleczyć myszy z wirusa HIV (łącząc technologię ze stosowaniem leków przeciwwirusowych).

Jeśli badania kliniczne potwierdzą skuteczność technologii, to możemy się spodziewać, że będziemy w stanie z sukcesem leczyć siedem tysięcy chorób genetycznych, a także wytworzyć takie białka we krwi, które będą walczyć z niektórymi nowotworami. Efektów dzisiejszych badań w postaci zarejestrowanych terapii należy się spodziewać nie wcześniej niż za kilka lat.

Wiosną 2018 roku jedna z matek technologii CRISPR-Cas9 Jennifer Doudna wymyśliła jeszcze jedno zastosowanie metody. Nie do leczenia, ale do diagnozowania chorób. W tym celu wykorzystuje się nieco inne enzymy Cas12 i Cas13. Stworzona przez nią firma ma wprowadzić na rynek łatwe w stosowaniu i tanie testy do wykrywania charakterystycznych fragmentów DNA naszych komórek albo DNA komórek nowotworowych. Takim testom można poddać pojedyncze osoby, jednak patrząc szerzej, mogą być stosowane w razie wybuchu epidemii do diagnozowania nosicieli i chorych.


Ulepszymy człowieka

Dalej, skoro różne choroby mają podłoże genetyczne, to najlepiej wyeliminować je na takim etapie rozwoju organizmu, na jakim to możliwe. Najłatwiej jest oczywiście na zarodkach. W zarodkach wystarczy wymienić DNA w jednej komórce, a nie w milionach lub miliardach. Jest to wykonalne, takich zmian dokonano już w kilku laboratoriach. Badania na zarodkach ludzkich są rzecz jasna kontrowersyjne, bo po przeprowadzeniu eksperymentu zarodki są niszczone (W Chinach i części UE są legalne, ale ich przeprowadzenie wymaga zezwoleń). Zasadnicza różnica pomiędzy modyfikacjami genetycznymi u dorosłych osobników i na zarodkach polega na tym, że zmiany wprowadzone w genomie zarodków... będą dziedziczone. Oznacza to, że obecnie pierwszy raz w dziejach posiedliśmy zdolność edycji DNA nie tylko każdego żyjącego człowieka, ale także przyszłych pokoleń, czyli w gruncie rzeczy kierowania ewolucją własnego gatunku. Dochodzimy też do bezprecedensowej możliwości włączania w nasz genom genów roślin i zwierząt, zmienienia dotychczasowej rasy homo sapiens w inną, lepszą, zdrowszą, żyjącą dłużej w lepszym zdrowiu.


Nie ma róży bez kolców

Należy pamiętać, że nawet CRISPR nie jest metodą idealną. Ostatnie badania nad samą metodą rzucają cień wątpliwości na jej przyszłość i rozwój. W opublikowanym w czasopiśmie „Nature” artykule opisano bowiem, że komórki wyedytowane przez CRISPR mogą mieć braki w mechanizmach obronnych, które zapobiegają powstawaniu w nich nowotworów. Badacze z instytutu Novartis w Cambridge wykazali, że zastosowanie systemu CRISPR-Cas jest toksyczne dla genu p53 odpowiedzialnego za ochronę przed nowotworami. Sprawne białko p53 powoduje apoptozę komórki zawierającej liczne pęknięcia DNA. Odkrycie to nie przekreśla przyszłego zastosowania tej metody w klinice, ale oznacza, że planowane terapie genowe bazujące na nukleazach i systemach CRISPR/Cas-9 powinny być monitorowane pod kątem funkcji szlaku p53. Są raporty, które informują, że i w tej metodzie zdarza się tak zwany off-target; Czasem jeden gen odpowiada za kilka cech, a interakcje genów mogą wywoływać efekty, których się nie spodziewamy.

Około dwóch tysięcy ludzkich cech jest w jakimś stopniu wynikiem ekspresji genów. CRISPR jest rewolucją, zwłaszcza dlatego, że pozwala na precyzyjne celowanie w pojedynczy gen. Opracowanie technologii CRISPR-Cas9 dodało nowe potężne narzędzie, dzięki któremu przygotowywane są terapie chorób genetycznych. Za kilka lat może to zmienić życie setek tysięcy ludzi cierpiących na choroby o podłożu genetycznym. Pozostaje wiele kwestii natury etycznej, prawnej i klinicznej, które wyjaśni przyszłość i niejako wskaże kierunek, w którym rozwinie się inżynieria genetyczna.

---

Źródła:

1. Bereta J., System CRISPR-Cas – od odporności bakterii do inżynierii genomowej, „Postepy Hig Med Dosw” (online), 2016; 70: 901–916.

2. Mojica F.J., Díez-Villaseñor C., Soria E., Juez G. (2000), Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria, „Mol Microbiol” 36: 244–246.

3. Wiedenheft M., Sternberg S.H., Doudna J.A. (2012), RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea, „Nature” 482: 331– 338.

4. Węgleński P., Edytowanie genów, „Postępy Biochemii” 64 (1) 2018.

5. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity, „Cell.” 2013;154(6):1380–1389. doi:10.1016/j.cell.2013.08.021.

6. Genetics Home Reference – What are genome editing and CRISPR-Cas9?, https://ghr.nlm.nih.gov [dostęp 7.08.2019].