nr 80-81 (2973-2974); 12-16 października 2000

• Nowe kierunki terapii HIV/AIDS -
  Prof. dr hab. n. med. Andrzej Gładysz, dr n. med. Brygida Knysz,
  Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych we Wrocławiu
  
  
  Postęp w badaniach nad patogenezą i terapią zakażeń HIV, jaki się dokonał w ostatnich latach, doprowadził do opracowania metod leczenia, które hamują replikację wirusa w stopniu pozwalającym na niewykrywanie wiremii nawet przez 2-3 lata.
  
  Efekt ten można obecnie uzyskać stosując leki antyretrowirusowe działające na dwa elementy cyklu biologicznego HIV, a mianowicie hamujące aktywność odwrotnej transkryptazy i proteazy. Niestety, pomimo niekwestionowanej skuteczności takiej terapii, nie udało się dotychczas uzyskać całkowitej eradykacji wirusa.
  
  Istotne znaczenie dla kontroli zakażeń HIV ma dokładne poznanie zjawisk związanych z replikacją wirusa oraz mechanizmów rozwijających się zaburzeń immunologicznych. Uważa się, że kompleksowa terapia antyretrowirusowa powinna zawierać leki o punktach uchwytu:
  
  a) hamujące poszczególne etapy replikacji wirusa HIV,
  
  b) wpływające na poprawę ilościową i jakościową układu immunologicznego.
  
  Do pierwszej grupy należą preparaty hamujące fuzję wirusa z komórką, jego replikację i dojrzewanie, do drugiej zaś związki powodujące wzmocnienie istniejącej odpowiedzi immunologicznej, produkcję nowych grup komórek immunologicznych oraz generację swoistej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko komórkom zakażonym HIV.
  
  Celem kompleksowej terapii antyretrowirusowej jest redukcja wiremii, odnowa układu immunologicznego oraz ochrona wrażliwych komórek przed zakażeniem.

  Terapia związana z wczesną fazą replikacji HIV

  Fuzja wirusa z komórką

  Szczególnie istotne jest opracowanie leków działających na wczesne fazy replikacji, co pozwoliłoby na zahamowanie rozprzestrzeniania zintegrowanych z komórkami gospodarza prowirusów. Jest to podstawowy, na obecnym etapie terapii, problem uniemożliwiający eradykację HIV. Leczenie takie polega na hamowaniu wiązania i fuzji wirusa z komórką gospodarza. Są to zjawiska złożone, wymagające interakcji wirusowych białek receptorowych gpl20 i gp41 z receptorami komórkowymi i koreceptorami. Glikoproteina gp41 poprzez C-koniec jest zakotwiczona w komórce wirusa. Zmiany konformacyjne gp41 prowadzą do interakcji końców C i N i zbliżenia błon obu komórek ułatwiającego fuzję. Udało się opracować peptyd naśladujący C-koniec gp 41, o nazwie pentafuzyd-T20. Obecnie prowadzone są badania I i II fazy, oceniające skuteczność i bezpieczeństwo tego preparatu. Wykazano, że dożylne podawanie pentafuzydu osobom zakażonym HIV przez okres kilku tygodni powoduje spadek wiremii o 99%. Do innych inhibitorów związanych z glikoproteinami należą inhibitory glukozydazy komórkowej. Glikozylacja jest zjawiskiem związanym z syntezą m.in. glikoprotein HIV. Dotychczas opracowano kilka inhibitorów glukozydazy, m.in. kastanosperminę. Niestety, preparaty te, z powodu nieselektywnego hamowania glikozylacji, również komórkowej, nie zostały poddane dalszym badaniom.
  
  Blokujące działanie na gpl20 wywierają również naładowane ujemnie polianiony, które łączą się z dodatnio naładowanymi cząstkami glikoproteiny.

  Chemokiny i receptory dla chemokin jako cel terapii antyretrowirusowej

  Niezwykle istotnym odkryciem było wykazanie w 1995 roku, że do zakażenia komórki przez HIV niezbędne są receptory dla chemokin. Badania nad samymi chemokinami poszły w dwóch kierunkach:
  • identyfikacji chemokin, receptorów i ich roli jako koreceptorów swoistych dla HIV,
  • opracowania terapii mającej na celu zapobieganie wykorzystaniu przez HIV receptorów dla chemokin.
  Zakażenie HIV inicjuje interakcje glikoproteiny otoczki wirusowej (gpl20/41) z receptorem CD4+ i koreceptorem. Szczepy HIV o tropizmie do makrofagów namnażają się m.in. w makrofagach i limfocytach CD4+, wykorzystując receptor CCR5. Ze względu na rodzaj koreceptora szczepy te sklasyfikowano jako R5. Koreceptor CCR5 wykorzystywany jest przez wszystkie szczepy pierwotne HIV, niezależnie od podtypu genowego. Szczepy HIV o tropizmie do limfocytów CD4+ replikują się pierwotnie w tych komórkach, wykorzystując jako koreceptor receptor CXCR4 i dlatego należą do grupy X4. Wirusy, które jako koreceptory wykorzystują zarówno CCR5, jak i CXCR4, określa się terminem R5X4. Typ R5 należy do najczęściej przekazywanych między ludźmi i jest obecny we wczesnej fazie zakażenia.
  
  Celem terapii związanej z chemokinami jest uniemożliwienie interakcji otoczki wirusa z powierzchnią komórki gospodarza. Można to uzyskać przez blokowanie ekspresji koreceptorów na powierzchni komórki lub blokowanie koreceptorów.

  Regulacja ekspresji koreceptorów

  Wykazano, że obniżenie liczby koreceptorów z 2000 do 700/komórkę w znacznym stopniu ogranicza wrażliwość na zakażenie. Wykazano również, że osoby z delecją w 32. parze zasad kodujących CCR5, będące homozygotami w tym zakresie, wykazują wysoką oporność na zakażenie HIV-1. Oporność jest wynikiem obniżonej ekspresji CCR5 na powierzchni komórki. Jednocześnie nie stwierdzono, aby taka mutacja wpływała na rozwój jakichkolwiek chorób. Z przedstawionych powyżej obserwacji wynikają badania nad opracowaniem terapii polegającej na sterowaniu ekspresją CCR5.
  
  Zaobserwowano, że aktywacja limfocytów CD4+ za pomocą przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw białkom powierzchniowym limfocytów CD23+ i CD28+ prowadzi do powstania komórek pamięci immunologicznej, które regulują ekspresją CCR5 i produkują czynniki hamujące replikację wirusów R5. Komórki aktywowane w ten sposób są oporne na infekcję typami R5, lecz wrażliwe na zakażenie R4. Ponadto wykazano, że w ten sposób indukowana oporność na zakażenie ma charakter przejściowy i zanika w ciągu tygodnia od usunięcia czynnika stymulującego.
  
  Przeprowadzono badania polegające na podaniu osobom zakażonym HIV-1, we wlewie kroplowym, trzykrotnie ich własnych limfocytów, które uprzednio stymulowano w hodowlach komórkowych przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw epitopom CD3+ i CD28+. U dwóch z trzech osób poddanych badaniu liczba limfocytów CD4+ była podwyższona przez ponad cztery miesiące. Mała liczba badanych, wynikająca z wysokich kosztów tych badań oraz niedogodności związanych z drogą podawania limfocytów, nie pozwala na wyciągnięcie ostatecznych wniosków. Niemniej jednak uzyskane już wyniki sugerują, że manipulacja sygnałem z CD28+, poprzez ograniczenie ekspresji koreceptora CCR5, może mieć znaczenie terapeutyczne.
  
  Do ograniczenia ekspresji koreceptorów na powierzchni komórki wykorzystano rybozymy, niedawno odkryte cząstki RNA o właściwościach enzymatycznych, posiadające zdolność cięcia innych łańcuchów RNA. Cięcie mRNA przez rybozymy może zapobiegać lub osłabiać translację białek kodowanych przez sekwencje, przeciwko którym skierowane są rybozymy. Przeprowadzono badania, w których użyto rybozymy skierowane przeciwko sekwencjom gag i sekwencji liderowej na końcu 5' genomu HIV-1. Sekwencja liderowa nie ma zdolności kodowania, ale posiada sygnały umożliwiające właściwe umiejscowienie na mRNA rybosomów dokonujących jego translacji. Obecnie udało się stworzyć rybozymy swoiste dla CCR5 i wykazano in vitro zdolność cięcia. Niestety, ten rodzaj terapii genowej jest w znacznym stopniu ograniczony z powodu wysokich kosztów badań i problemów technologicznych.

  Blokowanie receptorów dla chemokin

  Od chwili odkrycia chemokin zwrócono uwagę, ze względu na mechanizm ich działania, na możliwość wykorzystania ich jako preparatów antyretrowirusowych blokujących koreceptory dla HIV, co jest mało prawdopodobne z powodu prozapalnego działania chemokin, krótkiego okresu półtrwania, małej biodostępności. Zaobserwowano również w badaniach in vitro, że dodanie RANTES, MIP-l alfa i MIP-1 beta do komórek zakażonych HIV-1 zwiększało replikację wirusa, chociaż istnieją badania nie potwierdzające tej obserwacji.
  
  Celem prowadzonych badań jest taka modyfikacja chemokin, która w sposób wybiórczy będzie hamowała tylko replikację HIV-1. Trwają prace nad modyfikacją N końca chemokin, co ma prowadzić do powstania preparatów wykazujących jedynie działanie antyretrowirusowe. Inne modyfikacje polegały na dodaniu do RANTES reszty metioninowej (met-RANTES) lub grupy aminooksypentanowej (AOP- RANTES).
  
  AMD 3100, T22 i ALX 40- 4C stanowią rozpuszczalne, syntetyczne cząstki blokujące wnikanie do komórek szczepów T-tropowych oraz chemotaksję pod wpływem SDF-1.
  
  Do czynników blokujących receptory należą tzw. samobójcze wektory - wirusy (np. wścieklizny, ospy wietrznej i półpaśca), które zostały zmodyfikowane w taki sposób, że wykazują na swojej powierzchni ekspresję cząstek CD4+ i koreceptorów. Posiadają zdolność wiązania się z komórkami zakażonymi HIV-1 przez interakcję z gp 120, a następnie zabijania tych komórek. Dodatkową korzyścią wiążącą się ze stosowaniem takich wektorów jest możliwość przenoszenia leków w sposób celowany do zakażonej komórki. Trudno jest jednak ocenić skutki użycia żywych wektorów wirusowych u osób z deficytem immunologicznym. Próbowano również stosować przeciwciała monoklonalne przeciwko receptorom dla chemokin. Opracowano przeciwciała zarówno przeciwko CXCR4 (12 GS-mysie przeciwciało monoklonalne) i CCR5 (12 D7, 3A9). Mimo że praktyczne znaczenie takiego postępowania mogłoby być istotne w profilaktyce poekspozycyjnej, w tym również zapobieganiu transmisji matczyno-płodowej HIV, wysokie koszty oraz trudności w osiągnięciu komórek docelowych w sposób istotny ograniczają ten kierunek badań.

  Białka pomocnicze jako cel terapii antyretrowirusowej

  Białka pomocnicze (regulatorowe) HIV-1, podobnie jak geny je kodujące, stanowią ważny cel badań nad lekami przeciwwirusowymi, albowiem odgrywają istotną rolę w replikacji i patogenezie HIV. Każde z nich spełnia kilka funkcji w replikacji HIV.
  
  Białko Tat i Rev przedstawiono w dalszej części pracy na temat terapii genowej.
  
  Do innych białek regulatorowych spełniających liczne istotne funkcje związane z replikacją HIV należą Nef, Vif, Vpr i Vpu.
  
  Nef (czynnik negatywny) ulega aktywacji we wczesnej fazie replikacji HIV. Jego funkcja polega na hamowaniu krążenia receptora CD4+, oddolnej regulacji ekspresji antygenów zgodności tkankowej klasy I oraz Fas (co chroni komórki przed apoptozą). W badaniach na modelu zwierzęcym wykazano, że delecja Nef ma związek z niską aktywnością replikacyjną HIV-1, utrzymaniem prawidłowej liczby limfocytów CD4+ i brakiem objawów klinicznych. U osób nie wykazujących progresji zakażenia wykrywano szczepy nef-ułomne. Wykazano, że hamowanie aktywności komórkowej kinazy tyrozyny redukowało aktywność Nef.
  
  Vpr (białko wirusowe R) i MA (białko macierzy) biorą udział w transporcie do jądra materiału genetycznego wirusa, będącego w formie kompleksu przedintegracyjnego. W ten sposób przyczyniają się do integracji prowirusowego genomu z genomem komórki zakażonej. Ponadto Vpr wykazuje działanie cytostatyczne, umożliwiające replikację większej liczby cząstek wirusowych. Trwają obecnie badania nad opracowaniem inhibitorów MA.
  
  Vpu (białko wirusowe u) wpływa na uwalnianie wirionów z zakażonych komórek.

  Terapia genowa

  Replikacja wirusowa jest wynikiem interakcji pomiędzy genomami HIV i komórki, wirusowymi białkami regulatorowymi i czynnikami komórkowymi. Wśród białek regulatorowych niezwykle ważną rolę we wczesnej fazie replikacji odgrywają Tat i Rev. Białko Tat bierze udział w wydłużaniu mRNA, działając poprzez sekwencje TAR (Tat responsive element), wchodzące w skład regionu promotorowego LTR (long terminal repeat). Opracowano polimery TAR, które przenoszone w wektorach wirusowych (RSV-Rous sarcoma virus) lub plazmidach do hodowli komórkowych w znacznym stopniu hamowały replikację HIV. Mechanizm działania polegał na wyłapywaniu białka Tat przez wiązanie z syntetycznym TAR. Interakcje Tat-TAR są wysoce konserwatywne i takie same u wszystkich szczepów HIV, dlatego mało prawdopodobne byłoby powstanie lekoopornych mutantów.
  
  Białko Rev odgrywa rolę w syntezie wirusowych białek strukturalnych. Działa poprzez sekwencje RNA określone terminem RRE (Rev-responsive element), zlokalizowane w obrębie genów strukturalnych kodujących białka otoczki. Wpływa na transport materiału genetycznego wirusa z jądra do cytoplazmy. Zaobserwowano, że mutacje Rev mają związek ze spadkiem syntezy wirusowych białek strukturalnych. Opracowano geny dla mutanta określonego terminem M10. Wykazano in vitro hamowanie replikacji HIV po dodaniu do hodowli komórek zakażonych HIV, wektora RS V zawierającego geny M10.
  
  Wyprodukowano również hybrydy składające się z genów kodujących sekwencje TAR wyłapujące Tat i genów kodujących M10. Badania przeprowadzano tylko in vitro i nie można dotychczas ocenić jednoznacznie skuteczności preparatu, choć wydaje się, że kombinowaną terapię genową w porównaniu z monoterapią może charakteryzować wyższa skuteczność antyretrowirusowa. Inne możliwości terapii genowej wiążą się z opracowaniem genów inhibitorowych dla gag.
  
  Zastosowanie rybozymów przedstawiono wcześniej, w części dotyczącej ekspresji CCR5.
  
  Najczęściej stosowanymi w terapii genowej wektorami są retrowirusy, pozbawione zdolności replikacji. Stanowią system łatwo integrujący się z genomem gospodarza. Niestety, istnieje możliwość rekombinacji genetycznej zintegrowanego wirusa, co może prowadzić do zmiany genów funkcjonalnych lub aktywacji onkogenów. Należy również pamiętać o nieodwracalności objawów ubocznych, ponieważ informacja genetyczna jest stale wbudowywana w genom komórkowy. Ponadto, na dotychczasowym etapie badań istnieje mała wydajność trandukcji ludzkich limfocytów CD4+.
  
  Próbuje się stosować inne wektory, takie jak adenowirusy, wirus opryszczki zwykłej oraz syntetyczne wektory, jak polimery, poliaminy itp. Układy takie wymagają dalszych badań. Problemy związane z opracowaniem wektorów to ich mała biodostępność, indukcja odpowiedzi immunologicznej przeciw wektorom, ich mała penetracja do komórki (mało swoiste receptory) i do jądra.

  Terapia immunologiczna

  Do istotnych zaburzeń układu immunologicznego w przebiegu zakażenia HIV należą przede wszystkim: uszkodzenie ilościowe i jakościowe komórek pamięci CD4 (CD45RO+), natywnych CD4(CD45RA+), a także zaburzenie swoistej odpowiedzi komórkowej związanej z zakażeniem HIV (zwłaszcza o fenotypie TH1). Niestety, nawet stosowanie HAART nie powoduje całkowitej rekonstrukcji układu immunologicznego. Dlatego dąży się do opracowania takich metod leczenia, które będą miały wpływ bezpośrednio na układ immunologiczny. Taka terapia ma prowadzić do wzmocnienia istniejącej odpowiedzi immunologicznej, produkcji nowych grup komórek immunologicznych oraz generacji swoistej odpowiedzi skierowanej przeciwko komórkom zakażonym HIV.
  
  Obecnie badania nad terapią immunologiczną poszły w dwóch kierunkach:
  • zastosowania cytokin,
  • zastosowania szczepionek terapeutycznych.

  Cytokiny

  W bezobjawowej fazie zakażenia HIV dominują cytokiny produkowane przez limfocyty o fenotypie TH1, (produkujące interleukinę 2 (IL-2), interleukinę 12 (IL-12) i interferon gamma. Progresja zakażenia wiąże się z przewagą funkcji komórek o fenotypie TH2 i wyższą produkcją interleukiny 4 (IL-4) i interleukiny 10 (IL-10). Dlatego pod uwagę bierze się stosowanie IL-2, IL-12 oraz przeciwciał przeciwko IL-4 i IL-10. Najbardziej zaawansowane badania dotyczą IL-2 - glikoproteiny, która pobudza bezpośrednio limfocyty T, B, i komórki NK, a wtórnie m.in. interferon gamma, GM-CSF, czynnik martwicy nowotworów (TNF). Te cytokiny z kolei są stymulatorami limfocytów T cytotoksycznych, komórek NK, makrofagów i monocytów. Stwierdzono, że stosowanie IL-2 może stanowić istotny element terapii kombinowanej. W przeprowadzonych badaniach klinicznych obserwowano stymulację poliklonalną limfocytów CD4+, w równym stopniu wzrost liczby komórek natywnych i pamięci. Skuteczność IL-2 podawanej dożylnie i podskórnie była podobna. Objawy uboczne zależały od dawki, drogi podania i schematu stosowania preparatu. Wyższe dawki, zwłaszcza podawane we wlewie dożylnym, korelowały z większą częstością i nasileniem objawów ubocznych. Najczęściej obserwowano gorączkę, dreszcze, jadłowstręt, nudności, wymioty i biegunkę, czasem naciek w miejscu podania leku. Te zazwyczaj łagodne objawy uboczne ustępowały samoistnie w ciągu kilku dni od chwili przerwania leczenia. Zespół przecieku wośniczkowego przebiegający ze spadkiem ciśnienia tętniczego, obrzękiem płuc, zaburzeniem funkcji nerek stanowi poważne powikłanie stosowania IL-2, ale występuje na szczęście rzadko.
  
  Większość badań klinicznych dotyczących stosowania IL-2 była prowadzona przed erą HAART i już wówczas wykazano, że podawanie IL-2 łącznie z lekami antyretrowirusowymi powodowało większy wzrost liczby limfocytów CD4+ i spadek wiremii do wartości niewykrywalnych u wyższego odsetka osób zakażonych HIV.
  
  Obecnie trwają badania kliniczne nad stosowaniem IL-2 i HAART. Wstępne wyniki są obiecujące. Hengge i wsp. przeprowadzili randomizowane badania porównujące skuteczność terapii kombinowanej zawierającej IL-2 i HAART z HAART. Po roku terapii w grupie pacjentów, u których stosowano IL-2 i HAART, w przeciwieństwie do osób otrzymujących tylko HAART, obserwowano wzrost liczby limfocytów CD4+ średnio o 100 komórek/mL. W obu grupach nie wykazano wzrostu wiremii. U żadnej osoby otrzymującej IL-2 i HAART nie stwierdzano w ciągu następnych 11 miesięcy zakażeń oportunistycznych, w odróżnieniu od pacjentów leczonych HAART, gdzie w 3 przypadkach rozpoznano mięsaka Kaposiego. Równie obiecujące wyniki badań związane ze stosowaniem HAART i IL-2 uzyskali Stellbrink i wsp., Tambussi i wsp., Ruiz i wsp.

  Szczepionki terapeutyczne

  Celem stosowania szczepionek terapeutycznych jest ochrona przed progresją zakażenia. Istotną rolę w kontroli replikacji HIV odgrywają limfocyty T cytotoksyczne (CTL). Brak progresji zakażenia wiąże się z silną odpowiedzią CTL skierowaną przeciwko białkom kodowanym przez Gag (p24, p 17) i słabą przeciwko glikoproteinie otoczki gp 120, jak również silną odpowiedzią limfocytów TH1 (jak wspomniano wcześniej). Odpowiedź immunologiczna CTL anty-gag skierowana jest przeciw licznym epitopom konserwatywnym, co może tłumaczyć związek z brakiem progresji zakażenia u osób HIV+. Wykazano też, że pod wpływem HAART spada liczba CD8 CTL. Zjawisko to, nie do końca poznane, próbuje się tłumaczyć spadkiem wiremii, a tym samym - brakiem antygenu stanowiącego bodziec aktywujący CTL. Rozważa się stosowanie szczepionki terapeutycznej w momencie obniżenia wiremii do wartości niewykrywalnych, kiedy układ immunologiczny nie podlega już skrajnej aktywacji prowadzącej do anergii. Wówczas antygen szczepionkowy stanowi dodatkowy bodziec pobudzający swoistą odpowiedź immunologiczną, być może skuteczniej niż to jest obecnie możliwe eliminującą także cząstki prowirusa. Podanie antygenu szczepionkowego w kombinacji z HAART, jak również cytokinami może stanowić ważny element terapeutyczny. Najbardziej zaawansowane badania dotyczą obecnie trzech szczepionek:
  • Remunc (inaktywowana szczepionka zawierająca całe cząstki wirusa), badania I fazy;
  • p24- VLP (szczepionka produkowana na komórkach drożdży wykazujących ekspresję p24 i p 17), badania II fazy;
  • Vaxsyn (szczepionka rekombinowana gpl60).
  Uzyskane wyniki badań wskazują na skuteczność wymienionych powyżej szczepionek, wyrażającą się spadkiem wiremii. Jednakże brakuje obecnie obserwacji dotyczących stosowania szczepionek jednocześnie z HAART.
  
  Przedstawione powyżej badania stanowią tylko część obecnie prowadzonych. Zwraca uwagę ich wielokierunkowość i uwzględnianie coraz liczniejszych punktów uchwytu dla terapii. Wielokrotnie podkreśla się potrzebę stosowania terapii kombinowanej. Otwarte pozostaje pytanie, do jakiego stopnia będzie to leczenie wymagające stosowania wielu leków, i jak wielu w celu osiągnięcia optymalnego efektu w postaci całkowitej eliminacji HIV. Na obecnym etapie wiedzy nie można jeszcze powiedzieć, który z badanych leków będzie najskuteczniejszy i jaki kierunek badań przyniesie najlepsze efekty